Phương pháp MPN được đánh giá cao trong việc kiểm định chất lượng vi khuẩn trong nước thải, thường được sử dụng để đánh giá hiệu quả của hệ thống xử lý. Bài viết này cùng BIOGENCY tìm hiểu chi tiết hơn về phương pháp MPN và cách thực hiện.
Phương pháp MPN là gì?
Phương pháp MPN được viết tắt từ Most Probable Number. Đây là phương pháp sử dụng ước tính nồng độ các vi sinh vật khả thi trong một mẫu, bằng cách tái tạo sự tăng trưởng của vi sinh trong nước pha loãng gấp 10 lần. Phương pháp này thường sử dụng để ước tính quần thể vi sinh vật trong đất, nước, nông sản và đặc biệt hữu ích với các mẫu có chứa vật liệu hạt.
Phương pháp MPN thường được áp dụng để kiểm tra chất lượng nước, đảm bảo nước có an toàn hay không về mặt số lượng vi khuẩn có trong nước. Một nhóm vi khuẩn được gọi là Coliform đóng vai trò báo hiệu chỉ số ô nhiễm phân của nước. Sự hiện diện ít vi khuẩn này thể hiện nước không chứa sinh vật gây bệnh. Trong khi sự hiện diện của lượng vi khuẩn Coliform lớn thì khả năng rất cao là nước chứa sinh vật gây bệnh, không an toàn để sử dụng.
Nguyên tắc thực hiện phương pháp MPN
Nước được pha loãng và tiêm vào nước dùng đường sữa (Lactose). Vi khuẩn Coliform có trong nước sẽ sử dụng đường sữa trong dung môi để tạo ra Axit và khí. Sự hiện diện của axit được biểu thị bằng sự đổi màu sắc của môi trường và sự hiện diện của bọt khí thu được trong ống Durham úp ngược có trong môi trường dung môi.
Số lượng Coliform tổng được xác định bằng cách đếm số lượng ống khí cho phản ứng dương tính (nghĩa là thay đổi cả màu sắc và có sản xuất khí) và so sánh mô hình kết quả dương tính (số ống cho thấy sự phát triển ở mỗi độ pha loãng) với bảng thống kê tiêu chuẩn.
Ưu và nhược điểm phương pháp MPN
Ưu điểm của phương pháp MPN
- Dễ dàng giải thích, thông qua quan sát hoặc phát thải khí
- Mẫu độc tố được pha loãng
- Phương pháp hiệu quả để phân tích các mẫu có độ đục cao như trầm tích, bùn, v.v.
- Không thể phân tích bằng phương pháp lọc màng.
Nhược điểm của phương pháp MPN
- Phải mất một thời gian dài để có được kết quả
- Kết quả không chính xác lắm
- Cần nhiều phần cứng (đồ thủy tinh) và phương tiện hơn
- Xác suất dương tính giả
Các bước thực hiện phương pháp MPN
Kiểm tra bằng phương pháp MPN được thực hiện theo 3 bước cơ bản sau:
Bước 1: Kiểm tra giả định
Bước này nhằm sàng lọc lấy mẫu nước để tìm sự hiện diện của vi khuẩn Coliform. Nếu xét nghiệm là âm tính, không cần thực hiện thêm thử nghiệm nào nữa. Có thể kết luận nước đảm bảo về mặt vi sinh.
Nếu có bất kỳ ống nào trong chuỗi xuất hiện axit và khí, nước được coi là không an toàn. Thử nghiệm được xác nhận trên ống thể hiện phản ứng dương tính.
Yêu cầu
- Môi trường: Nước dùng Lactose hoặc nước dùng MacConkey hoặc nước dùng Lauryl tryptose (lactose)
- Đồ thủy tinh: Ống nghiệm các dung tích khác nhau (20ml, 10ml, 5ml), ống Durham
- Khác: Pipet vô trùng
Chuẩn bị môi trường
- Chuẩn bị môi trường (có thể là môi trường MacConkey hoặc môi trường Lactose) ở nồng độ đơn và đôi.
- Đối với nước chưa qua xử lý hoặc bị ô nhiễm: Phân phối môi trường nồng độ gấp đôi vào 10 ống (mỗi ống 10mL) và môi trường nồng độ đơn vào 5 ống (mỗi ống 10mL) và thêm một ống Durham ở vị trí đảo ngược.
- Đối với nước đã xử lý: Phân phối môi trường nồng độ gấp đôi vào 5 ống (mỗi ống 10mL) và 50mL môi trường nồng độ đơn vào 1 chai và thêm ống Durham ở vị trí lật ngược.
- Kiểm tra các ống để đảm bảo lọ bên trong chứa đầy chất lỏng và không có bọt khí.
- Tiệt trùng bằng cách hấp ở áp suất 15 lbs (121°C) trong 15 phút .
Quy trình xét nghiệm với phương pháp MPN
- Đối với nước chưa qua xử lý (bị ô nhiễm):
+ Lấy 5 ống nghiệm nồng độ gấp đôi và 10 ống nghiệm nồng độ đơn cho mỗi mẫu nước cần thử nghiệm.
+ Sử dụng pipet vô trùng, thêm 10 mL nước vào 5 ống nghiệm chứa 10mL môi trường nồng độ gấp đôi.
+ Tương tự như vậy, thêm 1 mL nước vào 5 ống chứa 10 mL môi trường nồng độ đơn và 0,1 mL nước vào 5 ống còn lại chứa 10mL môi trường nồng độ đơn.
+ Ủ tất cả các ống ở 37°C trong 24 giờ. Nếu không có ống nào có kết quả dương tính, ủ lại đến 48 giờ.
+ So sánh số ống nghiệm cho phản ứng dương tính với biểu đồ chuẩn và ghi lại số lượng vi khuẩn có trong đó.
Ví dụ, mẫu nước xét nghiệm cho kết quả 3–2–1 (3 × 10 mL dương tính, 2 × 1 mL dương tính, 1 × 0,1 mL dương tính) cho giá trị MPN là 17, tức là mẫu nước chứa ước tính 17 coliform trên 100 ml
- Đối với nước đã xử lý (không bị ô nhiễm):
+ Lấy 1 ống nồng độ đơn (50mL) và 5 ống nồng độ kép (10mL) cho mỗi mẫu nước cần thử nghiệm.
+ Sử dụng pipet vô trùng để thêm 50mL nước vào các ống chứa 50mL môi trường nồng độ đơn.
+ Tương tự như vậy, thêm 10 mL nước vào 5 ống nghiệm chứa 10ml môi trường nồng độ gấp đôi.
+ Ủ các ống nghiệm ở 37°C trong 24 giờ. Nếu không có ống nghiệm nào cho kết quả dương tính, ủ lại trong tối đa 48 giờ.
+ So sánh số ống nghiệm cho phản ứng dương tính với biểu đồ chuẩn và ghi lại số lượng vi khuẩn có trong đó.
Ví dụ, mẫu nước xét nghiệm cho kết quả 1-4 (1 × 50 mL dương tính, 4 × 10 mL dương tính) cho giá trị MPN là 16, tức là mẫu nước chứa ước tính 16 vi khuẩn coliform trên 100 mL.
Bước 2: Kiểm tra xác nhận
Một số loại vi sinh vật khác ngoài Coliform cũng tạo axit và khí trong quá trình lên men đường lactose. Do vậy, để xác nhận sự hiện diện của Coliform, cần tiến hành thử nghiệm xác nhận.
Mỗi ống lên men có kết quả dương tính cần chuyển một vòng môi trường vào:
- 3 ml nước dùng đường Lactose hoặc ống đã lên men đường Lactose màu xanh sáng.
- 1 môi trường thạch
- 3 ml nước Tryptone.
Ủ các ống lên men Lactose-Broth đã cấy ở 37°C và kiểm tra sự hình thành khí sau 24 ± 2 giờ. Nếu không thấy khí sinh ra, ủ thêm tối đa 48 ± 3 giờ để kiểm tra khí sinh ra.
Các mặt nghiêng của thạch nên được ủ ở 37°C trong 24± 2 giờ và các chế phẩm nhuộm Gram làm từ các mặt nghiêng này nên được kiểm tra bằng kính hiển vi.
Sự hình thành khí trong môi trường lactose và sự xuất hiện của trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử trong thạch tương ứng cho thấy sự hiện diện của thành viên nhóm vi khuẩn coliform trong mẫu được kiểm tra.
Việc không có sự hình thành khí trong môi trường lactose hoặc không tìm thấy trực khuẩn Gram âm, không tạo bào tử trong thạch nghiêng tương ứng được coi là xét nghiệm âm tính (không có vi khuẩn coliform trong mẫu thử) .
Xét nghiệm nước Tryptone:
- Ủ nước tryptone ở (44,5 ±0,2°C) trong 18-24 giờ
- Sau khi ủ, thêm khoảng 0,1 mL thuốc thử Kovacs và trộn nhẹ nhàng.
- Sự có mặt của indole được biểu thị bằng màu đỏ trong thuốc thử Kovacs, tạo thành một lớp màng trên pha nước của môi trường.
Các xét nghiệm xác nhận dương tính với indole, phát triển và sinh khí cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn E. coli chịu nhiệt.
Phát triển và sinh khí khi không có indole xác nhận vi khuẩn coliform chịu nhiệt.
Bước 3: Hoàn thành
Vì một số kết quả xét nghiệm dương tính có thể sai. Vì vậy mỗi chủng từ mỗi ống nghiệm dương tính cần được xác nhận trên đĩa thạch EMB hoặc Endo.
Sau khi ủ, tất cả các đĩa được kiểm tra để tìm sự hiện diện của khuẩn lạc điển hình. Vi khuẩn coliform tạo ra các khuẩn lạc có ánh kim màu xanh lục giúp phân biệt với các khuẩn lạc không phải vi khuẩn coliform (không có ánh kim). Sự hiện diện của khuẩn lạc ở nhiệt độ cao cho thấy sự có mặt của Ecoli chịu nhiệt.
Phương pháp MPN có khác với CFU trong xử lý nước thải?
Phương pháp MPN thường được so sánh với phương pháp CFU (Colony Forming Unit) vì cả 2 đều giúp xác định số lượng vi khuẩn có trong mẫu chất lỏng. Đồng thời đây là 2 phương pháp có độ tin cậy cao được công nhận trên 95%. Tuy nhiên 2 phương pháp này ứng dụng vào thực tiễn khác nhau:
- Đối với phương pháp CFU, vi khuẩn sẽ phát triển trong môi trường chất rắn như thạch
- Đối với phương pháp MPN, vi khuẩn sẽ được phát triển trong môi trường chất lỏng.
Bảng so sánh giữa phương pháp CFU và phương pháp MPN
| Phương pháp | Phương pháp CFU | Phương pháp MPN |
| Định nghĩa | CFU thể hiện số khuẩn lạc hay nấm có thể sinh sống được trong một mẫu nhất định. | MPN thay thế cho CFU, giúp đo lượng tế bào vi khuẩn có thể sinh tồn trong một mẫu chất lỏng. |
| Đơn vị tính | CFU/ml hoặc CFU g | MPN/100 ml |
| Phép tính | CFU tính bằng cách đếm số khuẩn lạc trồng trên đĩa thạch. | MPN tính bằng cách so sánh mẫu tích cực và tiêu cực của ống với bảng thống kê MPN. |
| Kỹ thuật pha loãng | Pha loãng nối tiếp sẽ được thực hiện trước khi đặt mẫu trên đĩa thạch. | Sự pha loãng nối tiếp thường sẽ không được thực hiện khi tính MPN |
| Phương pháp | Mảng lan truyền và đổ đĩa là hai phương pháp thực hiện để có được CFU. | Lên men nhiều ống là phương pháp để có được MPN. |
Trên đây là những chia sẻ về phương pháp MPN. Nếu bạn có bất kỳ thắc mắc có thể liên hệ qua số Hotline 0909 538 514 để được BIOGENCY giải đáp và tư vấn nhiệt tình.
>>> Xem thêm: Sản phẩm chứa vi khuẩn phản Nitrat hóa hoạt tính mạnh
