Xác định hàm lượng Protein bằng phương pháp Kjeldahl

Xác định hàm lượng Protein bằng phương pháp Kjeldahl có độ chính xác, độ lặp lại cao, khả năng áp dụng cho nhiều mẫu khác nhau nên được ứng dụng phổ biến. Dưới đây là nguyên lý và cách xác định đạm bằng phương pháp Kjeldahl.

Phương pháp Kjeldahl là gì?

Phương pháp Kjeldahl là một phương pháp hóa học kinh điển được dùng để xác định hàm lượng Nitơ toàn phần trong các chất hữu cơ. Kjeldahl được phát triển bởi một nhà sản xuất bia (Johann Kjeldahl) từ năm 1883, một loại thực phẩm được tiêu hóa bằng axit mạnh để giải phóng Nitơ, có thể được xác định bằng kỹ thuật chuẩn độ phù hợp.

Kjeldahl được nhiều tổ chức có tiếng công nhận như AOAC, ISO, USEPA, DIN, Pharmacopoeias. Hiện nay, Kjeldahl được xem là tiêu chuẩn trên toàn thế giới để tính toán hàm lượng Protein trong nhiều loại vật liệu như thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, đất, phân bón,…

Trong lĩnh vực xử lý nước thải, Kjeldahl là phương pháp quan trọng giúp phân tích mẫu nước thải, đánh giá mức độ ô nhiễm, theo dõi hiệu quả xử lý Nitơ trong các hệ thống xử lý nước thải.

Nguyên lý xác định hàm lượng Protein bằng phương pháp Kjeldahl

Phương pháp xác định đạm bao gồm sưởi ấm một chất với Axit Sulfuric, phân hủy các chất hữu cơ bằng quá trình oxy hóa để giải phóng lượng nitơ giảm như Amoni Sulfat. Trong bước này, Kali Sulphat (K₂SO₄), và Đồng Sunphat (CuSO₄.5H₂O) được thêm vào để tăng điểm sôi của môi trường (từ 337°C đến 373°C).

Sự phân hủy hoá học của mẫu hoàn tất khi môi trường ban đầu rất tối đã trở nên rõ ràng và không màu. Dung dịch này sau đó được chưng cất với một lượng nhỏ natri hydroxyd, chuyển muối amoni thành ammonia. Lượng amoniac hiện diện, và do đó lượng nitơ có trong mẫu, được xác định bằng phép chuẩn độ. Sự kết thúc của bình ngưng được nhúng vào một dung dịch axit boric hoặc acid sulfuric. Amoniac phản ứng với axit và phần còn lại của axit sau đó được trung hòa bằng NaOH 0.1N

a. Giai đoạn phá mẫu: Mẫu + H₂SO₄ → (NH₄) 2SO₄ (aq) + CO₂ (g) + SO₂ (g) + H₂O (g)

b. Giai đoạn chưng cất giải phóng Amoniac: (NH₄) 2SO₄ (aq) + 2NaOH → Na₂SO₄ (aq) + 2H₂O (l) + 2NH₃ (g)

c. Hấp thụ Amoniac: B (OH)₃ + H₂O + NH₃ → NH₄ + + B (OH)₄^–

d. Phản ứng ngược: B (OH)₃ + H₂O + H₂SO₄ → NaHCO₃ (aq) + NaB(OH)₄ (aq) + CO₂ (g) + HO

Hướng dẫn thao tác xác định hàm lượng Protein bằng phương pháp Kjeldahl

Phương pháp Kjeldahl dựa trên nguyên tắc xác định tổng hàm lượng nitơ trong mẫu, sau đó quy đổi ra hàm lượng protein theo một hệ số chuyển đổi phù hợp.

Chuẩn bị dụng cụ

• Bộ chưng cất Kjeldahl (hoặc thiết bị bán tự động).
• Bình phân hủy Kjeldahl.
• Bình hấp thụ (chứa dung dịch H₃BO₃).
• Buret chuẩn độ.
• Bếp điện, máy hút mùi.

Chuẩn bị hóa chất

• Axit sunfuric đậm đặc (H₂SO₄).
• Hỗn hợp xúc tác (K₂SO₄ + CuSO₄ theo tỷ lệ 10:1).
• Dung dịch NaOH 40–50%.
• Dung dịch axit chuẩn: HCl hoặc H₂SO₄ chuẩn (ví dụ 0,1 N).
• Dung dịch axit boric 2% (H₃BO₃).
• Chỉ thị hỗn hợp (methyl red + bromocresol green).

Cách pha hóa chất

Hóa chất cần dùng: H₂SO₄, CuSO₄, K₂SO₄, NaoH 40%, Chất chỉ thị màu, Ống chuẩn NaOH 0.1N, Ống chuẩn H₂SO₄ 0.1N. Cách pha như sau:

• (1) hỗn hợp xúc tác: Cân trước 1G CuSO₄ và 10G K₂SO₄
• (2) Chất chỉ thị màu: 0,25g Methylene blue + 0.5g Methylred + 50ml Ethanol.
• (3) Dung dịch NaOH 40%: Cân 404 g NaOH( 99.9%) vào bình định mức 1 Lít, dùng bình tia tráng sạch lên thể tích vừa 1 Lít.
• (4) Chất chỉ thị màu: Cân 0.25g Methylene blue + 0.5g Methyl red sau đó thêm 50ml Ethanol.
• (5) Pha dung dịch chuẩn: NaOH 0.1 N và H₂SO₄: 0.1 N: Lấy 1 ống chuẩn vào bình định mức, dùng bình tia tráng cho sạch sau đó đổ thêm nước cất vừa đủ 1 Lít.

Hướng dẫn chi tiết các thao tác

Giai đoạn Phân hủy

• Bước 1: Hút 1ml nước mắm cho vào bình phá mẫu Kjeldahl
• Bước 2: Cho thêm 15ml H2SO4 95-97%
• Bước 3: Thêm hỗn hợp xúc tác CuSO4 và K2SO4.

Để bình Kjeldahl khoảng 10-15 phút cho mẫu đồng đều, sau đó đốt đến khi dung dịch thu được màu vàng hoặc xanh trong suốt.

Giai đoạn chưng cất

• Bước 1: Hút 10ml dung dịch H2SO4 0.1N và 2 giọt chỉ thị màu vào bình tam giác 250ml hứng phần ngưng tụ.
• Bước 2: Kiểm tra độ kín của hệ thống nước hoàn lưu. Lưu ý khóa tất cả các van khi chưng cất.
• Bước 3: Chuyển toàn bộ mẫu ở bình Kjeldahl vào bình chưng cất, dùng nước tráng lại 03 lần.
• Bước 4: Thêm 30-40ml NaOH 40% vào bình chưng cất.
• Bước 5: Tiến hành chưng cất. Chờ bình tam giác ngưng tụ được khoảng 200ml.
• Bước 6: Rửa đuôi ống sinh hàn bằng nước cất sau đó cất thêm 1 phút nữa.

Chuẩn độ

• Bước 1: Điền đầy Buret 25ml với dung dịch NaOH 0.1N pha sẵn.
• Bước 2: Mang bình tam giác vừa ngưng tụ chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1N đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh lục sang màu tiam. Ghi thể tích NaOH 0.1N tiêu tốn.

Tính toán( Phương pháp tính Nitơ toàn phần)

Hàm lượng Nitơ toàn phần được tính theo công thức sau:

Phương pháp Kjeldahl dựa trên việc xác định tổng hàm lượng nitơ trong mẫu, rồi nhân với hệ số chuyển đổi (ví dụ 6,25) để tính ra hàm lượng protein. Tuy nhiên, trên thực tế, hạn chế của phương pháp Kjeldahl mà người thực hiện cần đặc biệt lưu tâm đó là tất cả Nitơ không ở dạng Protein, với các loại protein khác nhau thì cần các yếu tố hiệu chỉnh khác nhau do trình tự axit amin khác nhau. Đây là lý do hiện nay, để chính xác hơn, người ta có thể kết hợp Kjeldahl với các phương pháp khác (như Dumas, phân tích acid amin, hoặc loại trừ trước các hợp chất NPN).

Ngoài ra, việc sử dụng axit sunfuric đậm đặc ở nhiệt độ cao sẽ ít nhiều gây ra một mối nguy hại đáng kể và chất xúc tác cũng vậy. Vì thế để có thể thực hiện kỹ thuật này sẽ mất rất nhiều thời gian.

Hy vọng những chia sẻ trên đã mang đến thông tin hữu ích về xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl. Để tìm hiểu nhiều hơn về các phương pháp xử lý nước thải bằng chế phẩm vi sinh xin hãy liên hệ ngay đội ngũ BIOGENCY qua HOTLINE: 0909 538 514

>>> Xem thêm: Xác định hàm lượng nitơ với phương pháp Kjeldahl